Молекулярне фермерство: міняємо гумові чоботи на медичні рукавички

І він дійшов висновку, що той, хто зможе виростити два кукурудзяних качани або два колоси там, де раніше ріс лише один, матиме більше заслуг перед людством і краще послужить своїй країні, ніж усе плем’я політиків, разом узятих.

Джонатан Свіфт,
«Подорож до велетнів»

Уже близько тридцяти років фармацевтика синтезує білки, необхідні для лікування гормональних, онкологічних, серцево-судинних захворювань. Білки кодуються генами. Гени можна переносити з одних організмів в інші. Технологія називається генною або генетичною інженерією, отримані ж організми генетично модифікованими або трансгенними. Синтез білків відбувається в трансгенних мікроорганізмах, а порівняно недавно почали використовувати клітини ссавців і комах. Дехто скаже: «А навіщо це? Хочу мати ліки з природних джерел!» Будь ласка, але... природний препарат не завжди цілком сумісний з людським організмом, наприклад, інсулін із свині все-таки поступається людському, а іноді джерелом одержання цінного препарату є тільки плацента або абортовані людські ембріони. Іноді вартість таких ліків — просто позамежна для звичайного громадянина, особливо в нашій країні. Тож без генної інженерії не обійтися — лише вона дозволяє білок з одного організму формувати в клітині іншого, причому у великих обсягах. Тому виробництво рекомбінантних білків, тобто отриманих генно-інженерним шляхом, є найважливішою частиною сучасної біотехнології.

З виробничого і біологічного погляду рослини мають цілу низку переваг перед бактеріями і тваринними клітинами. Вони, наприклад, уміють синтезувати багато білків з повним набором функцій, як, наприклад, моноклональні антитіла, чого зовсім не можуть бактерії. Їх набагато легше розмножувати, і вартість їх вирощування набагато нижча, ніж робота з культурою тваринних клітин. І з біологічного погляду рослини безпечніші, тому що не містять вірусів і пріонів, які специфічні для людини і можуть міститися в препаратах, виготовлених із клітин ссавців. Немає в рослинах і ендотоксинів, які є в бактеріальних клітинах. Уже понад 15 років учені намагаються створити на основі рослин системи біосинтезу рекомбінантних фармацевтичних білків. Навіть назву придумали для цього виду людської діяльності — molecular farming («молекулярне фермерство»).

Перші роботи в молекулярному фермерстві велися шляхом отримання трансгенних рослин з вбудованими генами антитіл, фармацевтичних білків, вакцин. Результати цих робіт засвідчили, що рослини справді накопичують цілком функціональні білки, у тому числі й антитіла. Крім усього, ці роботи дали поштовх новому напряму — створенню їстівних вакцин.

Рослини можуть синтезувати певну кількість білка — поліпептиду, який містить антигенну детермінанту, що може викликати імунну відповідь. Сам по собі такий білок цілком позбавлений патогенних властивостей, оскільки це не бактерія і не вірус, а усього лиш частина протеїну, який у природі знаходиться на поверхні патогену. Цей поліпептид і буде рекомбінантною вакциною, на відміну від традиційних вакцин — ослаблених чи вбитих мікроорганізмів або вірусів, відомих із часів Пастера. Після виникнення імунної відповіді на цей білок людський організм може боротися і з самими бактеріями і вірусами, які мають таку антигенну мітку на своїй поверхні. Виявилося, що подеколи таку білок-вакцину можна і не очищати — достатньо з’їсти банан, яблуко, листочок салату, які містять цей поліпептид, щоб отримати імунітет проти хвороб. Американці навіть створили сухий сніданок із кукурудзи, що містить вакцину проти діареї, яку викликають деякі штами кишкової палички. У зв’язку із загрозою біологічного тероризму існують проекти зі створення їстівних рослинних вакцин проти сибірки, холери, чуми тощо.

Іноді трансгенні рослинні клітини не вирощують до цілих рослин, а культивують у стерильних умовах на штучному живильному середовищі, подібно до мікроорганізмів або тваринних клітин. Таким шляхом компанія Dow AgroSciences (США) розробила і нині готує до продажу вакцини від хвороби Ньюкасла у птахів, а ізраїльська компанія Protalix у доклінічних випробуваннях перевіряє фермент глюкоцереброзидазу, який виробляється трансгенними клітинами моркви. Такий фермент є ключовим у ферментно-замісній терапії хвороби Гоше (ця спадкова хвороба спричиняє різке зниження розумових здібностей). Річна вартість такого препарату, отриманого з плаценти, оцінюється в 300—400 тис. дол. для одного хворого, але синтез ферменту в рослинних клітинах дозволить відчутно знизити цю ціну.

Проте молекулярне рослинництво на основі трансгенних рослин ще не набуло широкого розвитку через низку обставин. У Європі поки що існує певне упередження проти самого поняття «трансгенні рослини». Іноді це призводить до появи проектів з вирощування в Ісландії, подалі від континенту, трансгенного ячменя для виробництва рекомбінантних білків. Проте упередження — не найголовніше. У галузі медицини генетична інженерія в Європі посідає певне місце, рекомбінантні білки виробляються в клітинах мікроорганізмів або ссавців на заводах великих європейських фармацевтичних компаній. Основні проблеми в іншому — низький рівень вмісту необхідного продукту (менш ніж 1% від загального білка) і досить тривалий час від одержання перших рослин до масового виробництва. Необхідно було знайти спосіб збільшення накопичення потрібного білка в рослинах і скоротити час від створення генетичної конструкції до одержання продукту.

Віруси рослин — ось можливий вихід. Після проникнення вірусної РНК у клітинах рослини відбувається стрімке накопичення вірусних білків. Віруси переносяться з однієї клітини в іншу. Ніякої генетичної трансформації самої рослини не потрібно. Кілька років знадобилося вченим із компанії Large Scale Biology Сo. (США) для створення системи виробництва рекомбінантних білків на основі вірусу тютюнової мозаїки. За допомогою цієї системи вдалось одержати персоналізовані вакцини для лікування однієї зі злоякісних лімфом у людей. Нині випробовується вакцина для профілактики захворювань у кішок. Для виробництва білків цим способом було побудовано цілий завод у штаті Кентуккі, відомому своїми тютюновими плантаціями. «Тютюн — не для паління» — от гасло цієї компанії.

Проте і цей спосіб виробництва білків у рослинах має недоліки. Вірус тютюнової мозаїки легко позбувається потрібного нам гена і повертається до «дикого» стану. Заражена рослина перестає виробляти необхідний продукт.

А чи не можна об’єднати систему генетичної трансформації рослин з вірусною системою синтезу білка? Причому так, щоб від трансформації збереглася лише система доставки ДНК у рослинну клітину, можливо, й без самої трансформації рослинного генома, а від вірусів — тільки синтез білка, можливо, і без утворення вірусних частинок. Природний «генний інженер» у рослин — це бактерія Agrobacterium tumefaciens. За її допомогою отримано багато трансгенних рослин, які вже вирощуються у світі на площі понад 80 млн. гектарів. На основі плазміди, маленької кільцевої молекули ДНК, яку взяли у цієї бактерії, були створені спеціальні системи перенесення генетичної інформації у рослини — вектори.

У нашому випадку в такий вектор були вбудовані спеціальні послідовності ДНК, які кодували вірусну РНК полімеразу (це фермент, який зчитує інформацію і синтезує так звану інформаційну РНК, матрицю для синтезу білка). У конструкцію було також вбудовано ген, що кодує цікавий для нас білок, під контролем спеціальних послідовностей, який згодом упізнаватиметься вірусною РНК полімеразою. Ця генетична конструкція може переноситися в клітини рослини за допомогою механізмів, які існують в Agrobacterium. Припускалося, що така система може працювати в рослинній клітині і без вбудовування в геном рослини, а відразу після того, як ДНК вектора потрапить до ядра клітини. Зчитування гена й створення білкового продукту називається експресією, а якщо така експресія відбувається без убудовування чужорідного гена в геном трансформованого організму, то кажуть, що це транзиєнтна, тобто тимчасова, експресія. У принципі, транзиєнтна експресія може відбуватися з будь-якою генетичною конструкцією, що потрапила усередину ядра клітини. Кількість білка, яка утвориться в результаті такої експресії, невелика, і раніше ніхто з дослідників не прагнув використовувати це явище для практичних цілей. Проте вбудовування вірусної РНК полімерази у векторну конструкцію, оптимізація структури самої конструкції, добір рослинного хазяїна привели до справжньої революції.

Для того щоб простежити накопичення необхідного продукту в рослинній клітині, потрібен репортер, тобто речовина, накопичення якої можна легко зафіксувати, бажано візуально. Найчастіше для цього використовують ген білка, виявленого в медузи. Цей білок може флуоресціювати при освітленні його ультрафіолетом, і тому його називають GFP, що перекладається з англійської «зелений флуоресціюючий білок». Ген цього білка було включено у вектор. У принципі майже всі рослини можуть бути потенційними донорами для таких генетичних конструкцій. Але найкращі результати поки що отримані для деяких родичів тютюну з Австралії. У листі одного з австралійських тютюнів, обробленому спеціальною векторною конструкцією, через один — два тижні майже всі рослинні білки зникали і накопичувався (до 80%) GFP. Тобто вся машина складання білків переключилася на біосинтез потрібного нам протеїну. Рослини просто випромінювали смарагдове сяйво, коли на них спрямовували ультрафіолетове світло (звичайні рослини флуоресціюють червоним світлом).

Система транзиєнтної експресії генів у листі рослин була перевірена для найрізноманітніших рекомбінантних білків. Звичайно, одних білків накопичувалося більше, інших менше, але принцип працював як для невеликих за розміром протеїнів, наприклад, людського інтерферону, так і для дуже великих, таких як антитіла, до яких входять малий і великий поліпептидні ланцюги. При підрахунку виявилося, що з одного кілограма рослинної біомаси можна одержати 1—5 грамів потрібного продукту. А деякі фармацевтичні білки неймовірно дорогі. Стоїть собі рослинка в горщику, а кожен її листочок коштує тисячу доларів.

Таким самим способом можна синтезувати вакцини. Причому в епоху, коли швидко змінюються біологічні загрози і мутують збудники хвороб, такий підхід за дуже короткий час дозволяє організувати виробництво необхідних вакцин.

Кому ж належить авторство цієї технології? Хоча наука не знає кордонів, у вчених є батьківщина. Статті, які розповіли про цю технологію, були надруковані в доповідях Національної академії наук США (PNAS) і Нейчур Біотехнолоджі (Nature Biotechnology). Половина авторів є представниками України, зокрема і керівник цих робіт Юрій Глеба, директор Інституту клітинної біології і генетичної інженерії Національної академії наук України. Завдяки тісним зв’язкам інституту з компанією Icon Genetics ці досягнення відразу стали використовуватися в Україні для розробки способів виробництва фармацевтичних білків. За допомогою цієї технології в Києві синтезовані перші зразки антивірусного препарату — інтерферону і гормону росту — соматотропіну і показана їхня біологічна еквівалентність.

Описана технологія хоча й дуже вдалий, але усього лиш один із прикладів сучасного молекулярного фермерства. Об’єднання генетичної інженерії і рослинництва — один з головних напрямів сучасної біотехнології. Воно вже не тільки приносить мільярдні прибутки провідним західним країнам, але і дає надію не дуже багатим людям мати доступ до сучасних медичних препаратів за прийнятними цінами.